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    細胞組織蛋白酶B(CATHEPSIN B)定量活性熒光檢測試劑盒

    更新時(shí)間:2024-04-08  |  點(diǎn)擊率:189

    細胞組織蛋白酶BCATHEPSIN B)活性熒光定量檢測試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

    (中文版)

     

    主要用途

     

      細胞組織蛋白酶BCATHEPSIN B)活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過(guò)二肽化合物底物z-FR-AMC,在組織蛋白酶L抑制劑的存在下,受到組織蛋白酶B的水解,釋放出熒光產(chǎn)物氨甲基,即采用熒光法來(lái)測定細胞裂解萃取樣品中酶活性

    而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品(動(dòng)物、人體、植物、昆蟲(chóng)等)組織蛋白酶BCATHEPSIN B的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩定。

     

    技術(shù)背景

     

    組織蛋白酶(CATHEPSIN),是一木瓜酶papain類(lèi)半胱氨天冬氨酸蛋白酶Cysteine or Aspartic protease),普遍存在于溶酶體細胞器內,在酸性環(huán)境下激活,切離各種目標蛋白。根據其結構和底物特異性,組織蛋白酶家屬約有十多種成員,包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細胞內蛋白和細胞外蛋白通過(guò)內吞進(jìn)行周轉中起著(zhù)重要作用,同時(shí)也是啟動(dòng)和傳遞細胞凋亡信號的替代機制,以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶BEC 3.4.22.1),又稱(chēng)為CTSB,作為溶酶體的標志性酶蛋白,可以使β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein)轉化為β-淀粉樣蛋白斑點(diǎn)(β-amyloid plaque在抗原處理(antigen processing)、腫瘤轉移、骨再吸收、細胞內或分泌性調節蛋白周轉、卵細胞成熟、細胞凋亡等方面具有重要作用。細胞間接觸和細胞外基質(zhì)成分影響43kd組織蛋白酶原L轉化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。半胱氨酸蛋白酶抑制劑ABCystatin AB)、S100A10等蛋白相互反應。組織蛋白酶B異常,導致阿茨罕默綜合癥(Alzheimer's disease、食道腫瘤esophageal adenocarcinoma等疾患。基于人工合成的肽化合物底物z-FR-AMCz-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin;乙酰苯丙精氨氨甲基,在組織蛋白酶L抑制劑Z-FY(t-Bu)-DMK的存在下,受到組織蛋白酶B的水解,釋放出熒光7-氨基-4-甲基7-amido-4-methylcoumarin;激發(fā)波長(cháng)360nm;散發(fā)波長(cháng)460nm,來(lái)定量測定組織蛋白酶B特異活性。組織蛋白酶B反應系統為:

     

     

    產(chǎn)品內容

     

      清理液(Reagent A        毫升

      裂解液(Reagent B        毫升

      緩沖液(Reagent C        毫升

      底物液(Reagent D          微升

      標準液(Reagent E         微升

    產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)              1

     

    保存方式

     

    保存  清理液(Reagent A)在4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里;  底物液(Reagent D  標準液(Reagent E避免光照和反復凍融;有效保證6

     

    用戶(hù)自備

     

    1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器

    15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

    細胞刮脫棒:用于脫離貼壁細胞

    微型臺式離心機:用于樣品沉淀

    培養箱:用于反應物孵育

    96孔板或比色皿:用于樣品熒光測定的容器

    熒光酶標儀或熒光分光光度儀:用于樣品熒光分析

     

    實(shí)驗步驟

      

    一、 樣品制備

     

    1. 準備好25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞(15 X 106細胞)

    2. 小心加入xx毫升  清理液(Reagent A,覆蓋生長(cháng)表面

    3. 小心抽去清理液

    4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞(注意:可以使用胰酶消化

    5. 加入xx毫升  清理液(Reagent A,混勻細胞

    6. 移入到預冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開(kāi)始

    7. 放進(jìn)4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為300g

    8. 小心抽去上清液

    9. 加入xx微升  裂解液(Reagent B,充分混勻

    10. 轉移到預冷的1.5毫升離心管

    11. 強力渦旋震蕩15

    12. 置于冰槽里孵育30分鐘

    13. 放進(jìn)4℃微型臺式離心機離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

    14. 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

    15. 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(注意:建議使用   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-   30030.1

    16. 即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

     

    二、 測定準備

     

    1. 準備好待測樣品(例如細胞裂解萃取液樣品等),置于冰槽里

    2. 設定好熒光分光光度儀(溫度為37℃):激發(fā)波長(cháng)360nm,散發(fā)波長(cháng)460nm,并置零 

    3. 準備好5個(gè)1.5毫升離心管,標記為15號管

    4. 分別加入xx微升  緩沖液(Reagent C25號管

    5. 移取xx微升  標準液(Reagent E1號管,混勻

    6. 小心移取xx微升1號管稀釋的  標準液(Reagent E2號管,混勻

    7. 小心移取xx微升2號管稀釋的  標準液(Reagent E3號管,混勻

    8. 小心移取xx微升3號管稀釋的  標準液(Reagent E4號管,混勻

    9. 15號管放進(jìn)冰槽里備用,避免光照;標準管濃度見(jiàn)下表

     

    管號

      緩沖液(Reagent C

      標準液(Reagent E

    標準AMC濃度

    1


    xx微升

    xx摩爾/

    2

    xx微升

    xx微升1號管

    xx摩爾/

    3

    xx微升

    xx微升2號管

    xx摩爾/

    4

    xx微升

    xx微升3號管

    xx摩爾/

    5

    xx微升

    0

    0

     

    三、 標準曲線(xiàn)測定

     

    1. 移取xx微升  緩沖液(Reagent C到新的比色皿

    2. 加入xx微升  底物液(Reagent D

    3. 加入xx微升上述配制的標準液

    4. 上下傾倒數次,混勻

    5. 37℃溫度下孵育60分鐘

    6. 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測:獲得相對熒光讀數Relative Fluorescence Unit;RFU

    7. 重復實(shí)驗步驟16四次

    8. 構建標準曲線(xiàn):縱座標(Y軸)為相對熒光單位RFU;橫座標(X軸)為標準AMC濃度(摩爾/

     

    四、 樣品測定

     

    1. 移取xx微升  緩沖液(Reagent C到新的比色皿

    2. 加入xx微升  底物液(Reagent D

    3. 加入10微升待測樣品(50微克細胞裂解萃取液蛋白)(注意:樣品須清澈

    4. 上下傾倒數次,混勻

    5. 37℃溫度下孵育60分鐘

    6. 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測:獲得樣品相對熒光讀數Relative Fluorescence Unit;RFU

    7. 根據標準曲線(xiàn)獲得樣品對應AMC濃度

     

    五、 計算樣品實(shí)際活性

     

     

    六、 酶標測定

     

    1. 96孔板上做好相應標記:標準樣品和待測樣品

    2. 分別移取xx微升  緩沖液(Reagent C到相應孔

    3. 分別加入xx微升  底物液(Reagent D

    4. 分別加入10微升上述配制的標準液或待測樣品(50微克細胞裂解萃取液蛋白)(注意:樣品須清澈

    5. 輕輕搖動(dòng)96孔板

    6. 37溫度下孵育60分鐘

    7. 即刻放進(jìn)熒光酶標儀檢測:獲得相對熒光讀數

    8. 構建標準曲線(xiàn):縱座標(Y軸)為相對熒光單位;橫座標(X軸)為標準AMC濃度(摩爾/

    9. 根據標準曲線(xiàn)獲得樣品對應AMC濃度

    10. 樣品實(shí)際活性計算:

     

     

    注意事項

     

    1. 本產(chǎn)品為20次操作

    2. 操作時(shí),須戴手套

    3. 系統操作過(guò)程中,標準曲線(xiàn)測定只需1

    4. 樣品須澄清,且避免反復凍融  

    5. 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升(本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒   30030.1

    6. 如果待測樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以調整樣品濃度

    7. 孵育反應完成后即刻進(jìn)行熒光測定

    8. 可以使用組織蛋白酶B抑制劑CA-074作為抑制劑對照或陰性對照

    9. 組織蛋白酶B單位活性定義為:在37,pH 5.5條件下,每分鐘內能夠切離1摩爾肽化合物底物z-FR-AMC所需的酶量作為一個(gè)活性單位

    10. 本公司提供系列組織蛋白酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品

     

    質(zhì)量標準

     

    1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定

    2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感


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